Cefalotin kém hấp thu ở đường tiêu hóa, nên phải tiêm. Sau khi tiêm bắp các liều 0,5 g và 1 g, trong vòng 30 phút sẽ đạt được nồng độ đỉnh huyết tương tương ứng là 10 μg và 20 μg/mL. Tiêm tĩnh mạch liều 1 g sẽ có nồng độ đỉnh huyết tương 30 μg/mL sau 15 phút. Tiêm truyền liên tục 500 mg/giờ sẽ có nồng độ đỉnh huyết tương từ 14 đến 20 μg/mL. Truyền tĩnh mạch liều 2 g trong 30 phút, nồng độ đỉnh huyết tương khoảng 90 μg/mL trong vòng 30 phút sau khi truyền. Tiêm truyền có hiệu quả hơn tiêm bắp vì quan trọng là nồng độ đỉnh đạt được cao hơn nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn.
Cefalotin phân bố rộng khắp các mô và dịch của cơ thể, trừ não và dịch não tủy. Cefalotin qua hàng rào nhau thai vào tuần hoàn thai nhi và có nồng độ thấp trong sữa mẹ. Thời gian bán thải từ 30-50 phút, nhưng có thể kéo dài hơn ở người suy thận. Khoảng 70% cefalotin gắn kết với protein huyết tương. Khoảng 20-30% cefalotin bị khử acetyl trong gan và khoảng 60-70% bài tiết qua nước tiểu.